在一項(xiàng)新的研究中，來(lái)自中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所、武漢金銀潭醫(yī)院和湖北省疾病預(yù)防控制中心的研究人員報(bào)道了位于中國(guó)中部的湖北省武漢市發(fā)生了一系列病因不明的肺炎疫情。從當(dāng)?shù)氐囊患液ｕr市場(chǎng)開(kāi)始，到2020年2月3日24:00，疫情已蔓延至中國(guó)有20438例感染，其中425人死亡，其他24個(gè)國(guó)家有161人感染。
相關(guān)研究結(jié)果于2020年2月3日在線發(fā)表在Nature期刊上，論文標(biāo)題為“A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin”。重要的是，Nature期刊在2020年1月20日收到這篇論文的手稿，1月29日就接受了這篇論文，并以“加快評(píng)審文章（Accelerated Article Preview）”的形式了在線發(fā)表了這篇論文。論文通訊作者為中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所石正麗（Zheng-Li Shi）研究員。
這些患者的典型臨床癥狀是發(fā)燒、干咳、呼吸困難、頭痛和肺炎。疾病發(fā)作后可因肺泡損傷導(dǎo)致進(jìn)行性呼吸衰竭（如橫向胸部CT圖像所觀察到的那樣），甚至死亡。
根據(jù)臨床癥狀和其他標(biāo)準(zhǔn)，包括臨床體溫升高，淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞減少（有時(shí)白細(xì)胞正常），胸部X光片上出現(xiàn)新的肺部浸潤(rùn)，三天抗生素治療無(wú)明顯好轉(zhuǎn)，臨床醫(yī)師將這種疾病確定為病毒性肺炎。大多數(shù)早期病例似乎都與最初的那家海鮮市場(chǎng)有接觸史，但是如今這種疾病已發(fā)展為人與人之間的傳播。
在疫情開(kāi)始時(shí)就進(jìn)入了重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）的7名重癥肺炎患者（其中有6名是海鮮市場(chǎng)銷(xiāo)售者或送貨者）的樣本被送至中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所（WIV）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原體診斷。
考慮這次疫情發(fā)生的環(huán)境與SARS相同，即在冬季和在一家海鮮市場(chǎng)里，石正麗及其課題組在冠狀病毒（CoV）實(shí)驗(yàn)室中首先使用泛冠狀病毒PCR引物來(lái)測(cè)試這些樣本。他們發(fā)現(xiàn)了5個(gè)PCR陽(yáng)性樣本。通過(guò)使用下一代測(cè)序（NGS）對(duì)從支氣管肺泡灌洗液（BALF）中收集的樣本（WIV04）進(jìn)行宏基因組分析以鑒定潛在的病原體。
在總共10038758個(gè)讀取片段（read），或者說(shuō)人類(lèi)基因組過(guò)濾后的總共1582個(gè)讀取片段中，有1378個(gè)讀取片段與SARS-CoV序列相匹配（圖1a）。通過(guò)從頭組裝和靶向PCR，他們獲得了一個(gè)大小29891bp的冠狀病毒基因組，它與SARS-CoV BJ01（GenBank登錄號(hào)AY278488.2）具有79.5％的序列一致性（sequence identity）。將這些1582個(gè)讀取片段與所獲得的基因組進(jìn)行重新映射可取得較高的基因組覆蓋。
這個(gè)基因組序列已被提交GISAID網(wǎng)站（登錄號(hào)EPI_ISL_402124）。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的名稱(chēng)，他們暫時(shí)將它稱(chēng)為新型冠狀病毒2019（2019-nCoV）。隨后從其他四名患者中使用下一代測(cè)序和PCR獲得了另外四個(gè)2019-nCoV全長(zhǎng)基因組序列（WIV02，WIV05，WIV06和WIV07）（GISAID登錄號(hào)EPI_ISL_402127-402130），彼此之間的一致性高于99.9％。
圖1.2019-nCoV的基因組特征，圖片來(lái)自Nature, 2020, doi:10.1038/s41586-020-2012-7。
2019-nCoV基因組由冠狀病毒共有的6個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框（ORF）和一些其他的附屬基因組成（圖1b）。進(jìn)一步的分析表明，一些2019-nCoV基因與SARS-CoV在核苷酸序列上的一致性低于80％。然而，用于冠狀病毒物種分類(lèi)的開(kāi)放閱讀框ORF1ab中的七個(gè)保守性復(fù)制酶結(jié)構(gòu)域在2019-nCoV和SARS-CoV之間具有94.6％的氨基酸序列一致性，這意味著這兩者屬于同一病毒物種。
他們隨后從蝙蝠冠狀病毒BatCoV RaTG13中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)短的RdRp區(qū)域，這個(gè)區(qū)域之前在云南省的中華菊頭蝠（Rhinolophus affinis）中檢測(cè)到，它與2019-nCoV具有高度的序列一致性。他們對(duì)這種RNA病毒樣本（GISAID登錄號(hào)EPI_ISL_402131）進(jìn)行全長(zhǎng)測(cè)序。Simplot分析顯示，2019-nCoV在整個(gè)基因組中與RaTG13非常相似（圖1c），全基因組序列一致性為96.2％。
通過(guò)使用2019-nCoV、RaTG13、SARS-CoV和先前報(bào)道的蝙蝠SARSr-CoV的比對(duì)基因組序列，在2019-nCoV基因組中未檢測(cè)到重組事件發(fā)生的證據(jù)。對(duì)全長(zhǎng)基因組、RNA依賴(lài)性RNA聚合酶（RdRp）基因和S基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析均顯示RaTG13與2019-nCoV存在最密切的親緣關(guān)系，但與其他SARSr-CoV形成不同的譜系（圖1d）。2019-nCoV的編碼受體結(jié)合蛋白---刺突蛋白（S）---的基因除了與RaTG13的S基因具有93.1%的核酸序列一致性外，與其他冠狀病毒高度不同，與所有先前描述的SARSr-CoV的核苷酸序列同一性低于75％。
2019-nCoV的S基因和RaTG13的S基因比其他SARSr-CoV要長(zhǎng)。與SARS-CoV相比，2019-nCoV的S蛋白的主要區(qū)別是N末端結(jié)構(gòu)域中的三個(gè)短插入序列和受體結(jié)合基序中的5個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基有4個(gè)發(fā)生了變化。2019-nCoV的S蛋白在N末端結(jié)構(gòu)域的插入序列是否具有像MERS-CoV那樣的唾液酸結(jié)合活性需要進(jìn)一步研究。2019-nCo與RaTG13存在密切的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系為2019-nCoV起源于蝙蝠提供了證據(jù)。
他們基于S基因的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（不同冠狀病毒基因組中變化最大的區(qū)域）快速開(kāi)發(fā)了一種qPCR檢測(cè)方法（圖1c）。他們的數(shù)據(jù)顯示，針對(duì)這種檢測(cè)方法設(shè)計(jì)的引物可以將2019-nCoV與所有其他人類(lèi)冠狀病毒（包括與SARS-CoV存在95％一致性的蝙蝠SARSr-CoV WIV1）區(qū)分開(kāi)。
在這7例患者中，他們?cè)卺槍?duì)qPCR和常規(guī)PCR測(cè)試的首次采樣期間，在6個(gè)BALF樣本和5個(gè)口腔拭子樣本中檢測(cè)到2019-nCoV陽(yáng)性。但是，在第二次采樣期間，他們?cè)趤?lái)自這些患者的口腔拭子、肛門(mén)拭子和血液中不再檢測(cè)到2019-nCoV陽(yáng)性（圖2a）。他們必須指出，包括RdRp或E基因在內(nèi)的其他qPCR靶標(biāo)可能用于常規(guī)檢測(cè)。基于這些發(fā)現(xiàn)，他們認(rèn)為這種疾病通過(guò)呼吸道傳播，但是如果將研究擴(kuò)大到更多的患者，他們不能排除還有其他的傳播可能性。
圖2.對(duì)患者樣本進(jìn)行分子和血清學(xué)研究，圖片來(lái)自Nature, 2020, doi:10.1038/s41586-020-2012-7。
為了對(duì)2019-nCoV進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，他們使用了先前開(kāi)發(fā)的蝙蝠SARSr-CoV Rp3核衣殼蛋白（NP）作為IgG和IgM ELISA測(cè)試中的抗原，這種核衣殼蛋白與2019-nCoV的核衣殼蛋白具有92％的氨基酸一致性，結(jié)果表明與除了SARSr-CoV之外的其他人類(lèi)冠狀病毒不存在交叉反應(yīng)。
作為研究實(shí)驗(yàn)室，他們只能從這7名病毒感染患者中獲得了5個(gè)血清樣本。他們?cè)诩膊“l(fā)作后的第7、8、9和18天監(jiān)測(cè)了其中的一名患者（ICU-06）的病毒抗體水平，結(jié)果觀察到明顯的IgG和IgM抗體滴度增加趨勢(shì)（在最后一天下降）（圖2b）。
在第二項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，他們?cè)诩膊“l(fā)作后約20天左右對(duì)這7例病毒陽(yáng)性患者中的5例進(jìn)行了病毒抗體檢測(cè)。所有患者樣本而不是健康人樣本，均顯示較強(qiáng)的病毒IgG陽(yáng)性（圖2b）。他們還發(fā)現(xiàn)了三個(gè)IgM陽(yáng)性樣本，這表明是急性感染。
他們隨后使用了來(lái)自ICU-06患者的BALF樣本在Vero細(xì)胞和Huh7細(xì)胞中成功分離出了這種病毒（名為2019-nCoV BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019，下稱(chēng)毒株WIV04）。在培養(yǎng)三天后，在細(xì)胞中觀察到明顯的致細(xì)胞病變作用。
通過(guò)使用交叉反應(yīng)性病毒核衣殼蛋白抗體進(jìn)行免疫熒光顯微鏡檢查、通過(guò)宏基因組測(cè)序表明它的大多數(shù)讀取序列可映射到2019-nCoV基因組以及qPCR測(cè)試表明病毒載量從第1天到第3天發(fā)生增加，毒株WIV04的身份在Vero E6細(xì)胞中得到了驗(yàn)證。
在電子顯微鏡下，受感染細(xì)胞的超薄切片中的病毒顆粒顯示出典型的冠狀病毒形態(tài)。為了進(jìn)一步確認(rèn)病毒IgG陽(yáng)性樣本的中和活性，他們使用5個(gè)IgG陽(yáng)性患者血清在Vero E6細(xì)胞中進(jìn)行了血清中和測(cè)定。他們證實(shí)所有血清樣本均能夠以1：40～1：80的稀釋度中和120 TCID50 2019-nCoV。他們還發(fā)現(xiàn)，這種病毒可以被馬抗SARS-CoV血清在1:80的稀釋度下交叉中和，但與SARS-CoV抗體交叉反應(yīng)的潛力需要通過(guò)人抗SARS-CoV血清加以驗(yàn)證。
血管緊張素轉(zhuǎn)化酶II（ACE2）被認(rèn)為SARS-CoV的細(xì)胞受體。為了確定2019-nCoV是否也將ACE2作為細(xì)胞進(jìn)入受體，他們使用表達(dá)或不表達(dá)人類(lèi)、中華菊頭蝠、果子貍、豬和小鼠的ACE2蛋白的HeLa細(xì)胞進(jìn)行了病毒感染性研究。
他們發(fā)現(xiàn)2019-nCoV能夠使用除小鼠ACE2以外的所有其他物種的ACE2蛋白作為表達(dá)ACE2的細(xì)胞中的進(jìn)入受體，但在不表達(dá)ACE2的細(xì)胞中不會(huì)如此，這表明它很可能是2019-nCoV的細(xì)胞受體（圖3）。他們還證實(shí)2019-nCoV不使用其他的冠狀病毒受體：氨基肽酶和二肽基肽酶4。
圖3.對(duì)2019-nCoV受體使用進(jìn)行分析，圖片來(lái)自Nature, 2020, doi:10.1038/s41586-020-2012-7。
這項(xiàng)研究提供了關(guān)于2019-nCoV的第一份詳細(xì)報(bào)道，其中2019-nCoV是造成中國(guó)中部武漢市正在發(fā)生的急性呼吸道綜合征疫情的可能病因。在所有測(cè)試的患者中觀察到的病毒特異性核苷酸陽(yáng)性和病毒蛋白血清轉(zhuǎn)化提供了這種疾病與這種病毒的存在之間存在關(guān)聯(lián)性的證據(jù)。
但是，仍然有許多緊急問(wèn)題需要解決。尚未通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)2019-nCoV與這種疾病之間的關(guān)聯(lián)性以充分符合科赫法則（Koch's Postulates）。
他們還不知道這種病毒在宿主之間的傳播途徑。這種病毒似乎在人與人之間傳播的可能性越來(lái)越大了。人們應(yīng)當(dāng)密切監(jiān)視這種病毒是否繼續(xù)演變成更強(qiáng)的毒性。由于缺乏特異性治療，并考慮到SARS-CoV與2019-nCoV之間的親緣性，一些針對(duì)SARS-CoV的藥物和臨床前疫苗可能會(huì)用于抵抗這種病毒。
最后，考慮到SARSr-CoV在它們的天然病毒庫(kù)中的廣泛傳播，未來(lái)的研究應(yīng)當(dāng)集中在更廣泛的地理區(qū)域?qū)λ鼈冞M(jìn)行主動(dòng)監(jiān)視。從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，應(yīng)當(dāng)為這類(lèi)病毒引起的未來(lái)新興傳染病準(zhǔn)備廣譜抗病毒藥物和疫苗。最重要的是，應(yīng)對(duì)野生動(dòng)物的馴養(yǎng)和消費(fèi)制定嚴(yán)格的法規(guī)。
參考資料：
Peng Zhou et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature, 2020, doi:10.1038/s41586-020-2012-7.